摘要：目的基于指纹图谱和网络药理学方法，分析预测当归四逆汤中单味药白芍潜在的质量标志物（Q-marker）。方法建立白芍水煎液和当归四逆汤指纹图谱，明确成分传递规律；进一步通过网络药理学方法，构建“成分-靶点-通路”网络，预测白芍的Q-marker。结果建立了15批白芍水煎液和15批当归四逆汤指纹图谱，并各指认其中5个色谱峰，分别为没食子酸、芍药内酯苷、芍药苷、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖和苯 芍药苷；经网络药理学分析，筛选出潜在的2个活性成分、8个核心靶点、13条关键通路，表明白芍主要通过这些成分、靶点、通路发挥作用，初步预测芍药苷、芍药内酯苷为白芍潜在的Q-marker。结论研究分析预测的Q-marker，为白芍质量的全面控制提供参考，同时也为白芍功效关联物质的研究及作用机制的阐释奠定基础。

白芍为毛茛科植物芍药PaeonialactifloraPall.的干燥根，具有养血调经、敛阴止汗、柔肝止痛、平抑肝阳的功效[1]；现代临床用于痛经、帕金森疾病、慢性萎缩性胃炎、类风湿性关节炎[2-4]等疾病的治疗。当归四逆汤（DangguiSiniDecoction，DSD）出自于东汉张仲景所著的《伤寒论》，原方由当归、桂枝、白芍、细辛、木通、甘草、大枣7味药组成，主治血虚寒厥证，具有温运血行、散寒通脉的功效[5]。现代临床在原方基础上，加减药味或联合其他化学药用于治疗糖尿病周围神经病变、类风湿性关节炎、子宫内膜异位症[6-9]等疾病。白芍为DSD中的臣药，在方中养血和营，助当归补益营血，是方中的重要组成部分[10]。

中药质量标志物（Q-marker）是近年来提出的中药质量评价与质量控制的核心概念，其基于有效、特有、传递与溯源、可测和处方配伍的“五原则”[11-12]，目前已用于药材、饮片、复方Q-marker的研究。Q-marker概念的提出，为中药的质量控制研究指明了方向，为后续研究中药发挥作用的机制奠定了基础。中药指纹图谱具有整体性和模糊性的特点，能反映中药及制剂内在质量的稳定性和均一性[13-14]。网络药理学是建立在系统生物学和网络生物学基础上的研究方法，能够推动对药物作用机制的认识，加速药物靶点的确认以及发现生物标志物[15-16]。本研究选取经典名方DSD中单味药白芍为研究对象，从Q-marker的“五原则”出发，结合指纹图谱及网络药理学方法，从化学和生物信息角度预测分析白芍潜在的Q-marker，为白芍的质量控制及后续开发研究提供参考。

1材料

1.1仪器

Waterse高效液相色谱仪，包括四元泵、柱温箱、自动进样器、PDA检测器和Empower工作站（美国Waters公司）；MS-DU电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-B数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；H-W台式高速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；TD1C电子天平（天津天马衡基仪器有限公司）。

1.2试药

芍药内酯苷（批号）、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖（批号）、苯 芍药苷（批号）均购自上海诗丹德标准技术服务有限公司；没食子酸（批号-）、芍药苷（批号-）购自中国食品药品检定研究院；乙腈（色谱纯，德国Merck公司）；纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）；其他试剂均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。白芍饮片（编号B1～B15，产地安徽亳州）、当归饮片（产地甘肃岷县）、桂枝饮片（产地广西东兴）、细辛饮片（产地辽宁新宾）、木通饮片（产地河南洛阳）、甘草饮片（产地甘肃陇西）、大枣饮片（产地山西闻喜）。经南京中医药大学药学院陈建伟教授鉴定分别为毛莨科植物芍药PaeonialactifloraPall.的干燥根、伞形科植物当归Angelicasinensis(Oliv.)Diels.的干燥根、樟科植物肉桂CinnamomumcassiaPresl.的干燥嫩枝、马兜铃科植物北细辛AsarumheterotropoidesFr.Schmidtvar.mandshuricum(Maxim.)Kitag.的干燥根和根茎、木通科植物三叶木通Akebiatrifoliata(Thunb.)Koidz.的干燥藤茎、豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根和根茎、鼠李科植物枣ZiziphusjujubaMill.的干燥成熟果实。白芍及DSD各研究15个批次。

2方法与结果

2.1色谱条件

MerckPurospherStarLPRP-18endcapped（mm×4.6mm，5μm）色谱柱；流动相乙腈（A）-0.05% 水溶液（B），梯度洗脱：0～8min，5%～10%A；8～15min，10%～13%A；15～24min，13%～15%A；24～30min，15%～17%A；30～35min，17%～20%A；34～45min，20%～30%A；45～50min，30%～45%A；50～65min，45%～80%A；65～70min，80%～95%A；体积流量1mL/min；检测波长nm；柱温30℃；进样量10μL。

2.2样品制备

《伤寒论》中记载当归四逆汤的用法用量为：“当归三两，桂枝三两（去皮），芍药三两，细辛三两，甘草二两（炙），通草二两，大枣二十五枚（擘）。上七味，以水八升，煮取三升，去滓，温服一升，日三服。”本研究在前期试验已确定处方剂量的基础上，按一两为13.8g，大枣二十五枚为8枚（约62.5g），一升为mL计算，称取处方药味，置陶瓷锅中，加水mL，先武火煮沸，后文火保持微沸煎至mL，以80目筛滤过，即得水煎液样品。按以上方法制备15批DSD样品、15批白芍水煎液样品及1批缺白芍阴性水煎液样品。饮片编号为B1～B15的白芍饮片煎煮得到对应编号为S1～S15的白芍饮片水煎液样品、编号为DSD1～DSD15的当归四逆汤样品；缺白芍阴性水煎液样品编号为YX1。

2.3供试品溶液的制备

取白芍水煎液、DSD及缺白芍阴性水煎液样品摇匀，精密量取3mL，置10mL量瓶中，加 5mL，超声处理30min，放冷，加 至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4对照品溶液的制备

精密称取没食子酸、芍药内酯苷、芍药苷、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖和苯 芍药苷对照品适量，以 溶解，得到质量浓度分别为54.4、74.5、.9、.6、6.5mg/L的混合对照品溶液。

2.5方法学考察

2.5.1参照峰的选择《中国药典》年版将芍药苷作为评价白芍质量的指标性成分，其含量较高，色谱峰较稳定，故选择芍药苷作为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。

2.5.2精密度试验取DSD11，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次进行测定。结果表明DSD各共有峰的相对保留时间RSD＜0.21%，相对峰面积RSD＜2.9%，表明仪器精密度良好。

2.5.3重复性试验取同一批DSD11，按“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定。结果DSD各共有峰的相对保留时间RSD＜0.23%，相对峰面积RSD＜3.0%，表明该方法重复性良好。

2.5.4稳定性试验取DSD11，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别在供试品溶液制备后0、4、8、12、24、48h按“2.1”项下色谱条件进行测定。结果表明DSD各共有峰的相对保留时间RSD＜0.15%，相对峰面积RSD＜3.0%，表明DSD供试品溶液在48h内稳定。

2.6指纹图谱研究

2.6.1指纹图谱建立及相似度评价取15批DSD及15批白芍水煎液样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行检测，记录色谱图。通过中药色谱指纹图谱相似度评价系统（年版）软件，分别以DSD11和S11的指纹图谱作为参照图谱，采用平均数法，进行多点校正和色谱峰匹配，自动匹配生成指纹图谱共有模式。相似度评价结果表明，15批DSD的相似度在0.～0.，表明15批DSD具有较好的一致性；15批白芍水煎液相似度在0.～0.，表明同一产地的15批白芍饮片质量较为稳定均一。15批DSD及15批白芍水煎液指纹图谱叠加图见图1、2，共有模式及对照品图谱见图3，相似度结果见表1。

2.6.2指纹图谱结果分析实验得到的DSD与缺白芍阴性水煎液、白芍水煎液指纹图谱见图4。

DSD指纹图谱可确定25个共有峰，白芍水煎液指纹图谱可确定9个共有峰，通过比对DSD、缺白芍阴性水煎液及白芍水煎液的指纹图谱可知，2号峰（没食子酸）、7号峰（芍药内酯苷）、8号峰（芍药苷）、11号峰、24号峰来自于白芍，而12号峰（1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖）、15号峰（苯

芍药苷）、17号峰、25号峰虽在白芍中可指认到，但可能由于复方成分复杂，在DSD中有一定干扰。

2.7网络药理学研究

2.7.1候选化合物靶点预测通过检索中药系统药理数据库（TCMSP，